背景介绍
达依泊汀-α（Darbepoetin alfa, DEPO-α）是高度糖基化的类人红细胞生成素（erythropoietin, EPO）重组蛋白。该蛋白含有一个O-糖基化作用位点和五个N-糖基化作用位点，最多能形成22个唾液酸，而唾液酸的含量决定了DEPO的生物半衰期和生物活性：DEPO 的半衰期能够达到25.3h，而人红细胞生成素的半衰期只有8.5h。
由于糖链数量和单糖含量的不同，翻译后修饰作用使DEPO存在20多种糖基化模式；而聚糖支链包含不同数量的末端唾液酸，后者又存在乙酰化和氧化等修饰作用。以上的修饰作用形成了超过40种DEPO异构体，质量分布在35.8kDa至38kDa。
综上可以看出唾液酸化程度对DEPO生物活性有着直接的影响，在DEPO生产过程中，保证重组蛋白的唾液酸含量是极为关键的。而唾液酸化的程度会影响蛋白的电荷及等电点，因此等电点聚焦（isoelectric focusing, IEF）技术和毛细管电泳技术是优选的检测分析方法。
目前对于提升CHO细胞代谢产物重组蛋白糖基化或唾液酸化的方法如图1所示。当大量的重组蛋白在胞内发生糖基化修饰时，参与催化聚糖运输、组装以及整合到多肽链上的酶含量不足，并且参加糖基化反应的基础底物含量也会出现短缺，因此，我们可以采用提升相关酶表达水平以及向培养体系中添加关键底物来打破糖基化修饰过程中的瓶颈。此外，培养过程中死细胞所释放出来的糖苷酶能够降解聚糖，从而降低了糖蛋白的质量，抑制胞内糖苷酶的活性也是一种提升糖基化水平的方法。但是当细胞活率高于80%时，后者对于重组蛋白糖基化的影响是极小的。
以往的文献中报道向培养体系中添加关键性底物及其衍生物，能够有效促进重组蛋白的糖基化，其中单糖和核苷是最有效的添加剂，如：
1. 向培养基中添加1mM尿苷和2μM氯化锰，能够显著提高单克隆抗体中半乳糖的含量；
2. 添加20mM N-乙酰-D-甘露糖胺促进了干扰素γ的唾液酸化；
3. 10mM半乳糖和2mM尿苷联合使用提升了重组蛋白干扰素β-1α的糖基化含量。
本文采用向培养基中添加基于单糖类的糖基化反应关键底物及其前体或衍生物，以此筛选出最有效的添加剂，达到通过CHO细胞悬浮培养提升重组蛋白DEPO高度唾液酸化异构体的表达量。
2实验材料及方法
用含有DEPO基因的质粒转染CHO细胞株，构建出生长状态良好、代谢表达稳定DEPO稳定克隆细胞株。本文所采用的基础培养基和流加培养基如下表所示。流加策略基于基础培养基和流加培养基中葡萄糖的含量。
本论文所筛选的添加剂如下表所示。
反相HPLC技术和IEF技术分别用来分析培养液中DEPO的浓度和糖基化作用。美国Amgen公司生产的经典DEPO-Aranesp用于本论文的标准对照，其包含了六种异构体（#17-22）。
3实验结果
糖基化优化的第一阶段是DEPO克隆细胞株培养基的筛选。通过对下图所示不同培养基条件下的样品进行分析，比较DEPO克隆以及对照标准品在IEF中的结果，发现基础培养基Power CHO-2 CD和流加培养基Power Feed A搭配脂类条件下的DEPO的#17-20异构体具有高表达。作者对比六种培养基条件下的IEF结果提出脂类可能是DEPO唾液酸化的主要原因。
进一步的对照实验验证了该假设。实验结果如图3所示。但是基础培养基与含脂类的流加培养基组合培养只能使#17-20异构体具备高表达，而更高水平的唾液酸化，包括#21和#22，表达量很小甚至不表达。对此，进一步的实验通过向培养体系中添加各种不同的添加剂，以检测其对于DEPO高度唾液酸化的促进作用。
实验结果结果显示尿苷，半乳糖，N-乙酰-D-半乳糖胺，N-乙酰-D-葡萄糖胺以及甘露糖分别搭配10mM葡萄糖胺，对于细胞的生长和DEPO唾液酸化均无促进作用。而10mM N-乙酰-D-甘露糖胺和10mM N-乙酰神经氨酸的添加，明显促进了DEPO的唾液酸化水平，#17-21异构体均有高表达量（图4）。
最后，为了进一步降低生产成本及简化工艺，测试了单独添加N-乙酰-D-甘露糖胺对DEPO唾液酸化的影响。实验方案和结果如图5所示：相较于10mM的流加量，20mM的N-乙酰-D-甘露糖胺流加组中DEPO表现出更高水平的唾液酸化，并且后者能够减弱脂类添加剂的作用。当去除脂类后（Well 5），DEPO唾液酸化与添加组（Well 4）相当。
4讨论
N-乙酰神经氨酸及其前体N-乙酰-D-甘露糖胺，二者均能够被用于合成胞苷5'-单磷酸-N-乙酰神经氨酸，而后者是唾液酸化的关键性底物。这也解释了这两类添加剂的使用对于DEPO唾液酸化的促进作用。由于葡萄糖胺向目标底物的转化需要9个连续的反应，并且其中包含一个限速反应，因此其对于DEPO唾液酸化的影响受到了限制。
脂类添加剂中所包含的水溶性脂肪酸是多萜醇的前体，而后者直接参与了糖基化反应，因此脂质体的添加能为DEPO唾液酸化提供充足的反应底物。
我们也可以得出，基于糖苷结构、功能和生物作用，在培养体系中使用合适的添加剂，能够显著的影响糖蛋白的唾液酸表型，进而影响目标蛋白的生物活性。
参考文献
Savinova, I. N., et al. (2015). Applied Biochemistry and Microbiology 51(8): 827-833.
小贴士
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N-乙酰-D-甘露糖胺
N-Acetyl-D-mannosamine，货号PHG0017
D-(+)-半乳糖
D-(+)-Galactose，货号G5388
尿嘧啶核苷
Uridine，货号U3003
