【小编】抗体药物N-糖基化的分析和控制

糖基化修饰占到所有PTM（Post-translational Modification，翻译后修饰）的50%以上，对于治疗性蛋白药物（如重组蛋白药物、抗体药物），通过对免疫原性、半衰期、效应因子作用等的影响，对其安全性和有效性起到重要作用。从1986年批准第一个抗体药物OKT3至今，FDA已经批准了63个抗体药物和14个融合蛋白药物，以及其他很多蛋白药物（凝血因子、重组酶等），这些药物的应用极大改变了很多疾病的治疗格局。这其中多数药物带有糖基化修饰，本文重点介绍但不限于抗体药物的糖基化修饰。

糖基化修饰受细胞系、培养条件、纯化工艺等多因素的影响，学术界和工业界也发展了许多糖基化分析技术，对于糖基化过程和影响都有了更深的理解，也有助于更好的控制糖基化修饰的过程。

抗体药物的糖基化形式主要为N-糖基化，涉及的单糖主要：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、岩藻糖、唾液酸（NANA、NGNA）。

抗体药物的糖型主要包括如下几种。

以CD52单抗阿仑单抗（商品名Campath）为例，其糖基化类型为经典的N-glycan，位点在IgG1的N297位。阿仑单抗的靶点为CD52，CD52的糖基化为完全唾液酸化的形式，从下图可见，CD52的糖基部分比CD52多肽还要更大一些。

人体血浆IgG大约有20%包含Fab糖基化修饰，治疗性抗体中则一般选用单纯Fc N-糖基化修饰的结构。所有治疗性抗体中，仅有一个特例：西妥昔单抗。西妥昔单抗重链可变区含有一个N-糖基化位点。Fc的糖型为G1F，Fab的糖型为G4F（4个半乳糖）。

糖基化修饰的分析和控制面临诸多挑战，结构-功能关系（SAR）、细胞系筛选、糖基化改造、工艺控制、纯化策略、糖型分析、监管准入等都为抗体药物开发带来一些列挑战。

抗体药物糖基化对活性、半衰期等有明显影响，但仍有许多SAR关系待研究阐明。

表一几种常见糖型对抗体性质的影响

N-glycan  糖型	对抗体性质的影响
	Man5：高甘露糖糖型，导致快速清除，半衰期缩短。
	G0F：促进补体通路作用，加快清除速率。
	G2F：在孕妇和新生儿脐带中含量增加。
	唾液酸：唾液酸修饰对静脉注射免疫球蛋白的炎症作用影响明显。
	去岩藻糖基化：岩藻糖的去除导致ADCC活性明显增强。

下图以曲妥珠单抗为例，与血浆IgG糖谱进行对比，可见曲妥珠单抗主要糖型为：G0F、G1F、G2F，其中G0F最多。区别有如下几点：曲妥珠单抗有少量高甘露糖组分Man5，而血浆IgG没有，主要由于其被甘露糖受体介导快速清除；血浆IgG唾液酸化组分明显更高，主要由于20%IgG含有Fab糖基化修饰（高唾液酸化）；血浆IgG含有Bisecting GlcNAc和Neu5Ac，CHO表达的曲妥珠单抗则没有。

唾液酸还有可能对炎症反应起到介导作用，虽然并无确论，但的确发现非人源的唾液酸修饰NGNA会引起严重的炎症反应。

尽管抗体药物生产工艺发展迅速，过敏反应仍有1-3%的发生率。目前已经证实糖基化组分导致的过敏反应主要是由IgE介导的。在Chung等人进行的一项标志性的研究中，发现西妥昔单抗的过敏反应案例即源于抗α-gal的IgE抗体。有意思的是，西妥昔单抗的过敏反应与Fab的α-gal有关，与Fc的α-gal无关，因为前者与IgE接触面更大更容易结合。在同样用Sp2/0、NS0细胞系表达的英夫利昔单抗、帕立珠单抗中虽然也有微量α-gal，但不会引起过敏反应，因其发生在Fc域。

糖基化分析可以从三个维度进行：全分子分析、糖肽分析和releasedglycan分析。

单糖的确定则需要借助一系列糖苷酶：

通过多个糖苷酶依次酶切即可鉴定单糖组分。

Releasedglycan的分析是抗体药物糖基化分析非常重要的部分，借助PNGase F切掉N-glycan，通过荧光分子如2-AB标记，借助UPLC分离进行分析。

近年来两种基于N-hydroxy succinimide-activated carbamate的新标记方法已经出现：RapiFluor-MSTM (RFMS) 和 6-aminoquinolyl-N-hydroxy succinimidyl carbamate (AQC) ，样品准备的时间大大缩短，效率得到明显提高。

必要时可以采取基于机器人的高通量糖基化分析平台。

糖基化分析案例：ESI（电喷雾离子化）源与高分辨质谱联用是检测蛋白分子量的常用手段。以单克隆抗体为例，其完整分子量接近150kDa，在ESI源内可携带上多个电荷（40-70左右）使得单抗的质荷比（m/z）范围在2500-3500之间。在此m/z区域内，TOF和Orbitrap等高分辨质谱均可以分辨单克隆抗体的不同糖型。

以Rituximab为例进行说明。Rituximab的结构下图所示，是一个经典的IgG1抗体。和大多数药用单抗一样，仅在Fc区域有一个N糖基化位点。

 
▲Rituximab分子结构简图

Rituximab经过RP-LC分离后，经Q-Exactive质谱仪检测得到的完整分子量质谱图。

如上图，Rituximab的m/z落在1800-5000范围内，呈现蛋白大分子的典型电荷分布。图中丰度最高价态为+45，将其放大（zoom）后可以明显看到四种分布最高的糖型修饰被很好的分离。原始质谱图经软件去卷积化处理后，结果如下图。从图中可以看出，在完整分子量水平上，可以判断单抗的主要糖型为G0F/G0F、G0F/G1F、G1F/G1F（或G0F/G2F）和G1F/G2F。

▲ Rituximab MS去卷积化处理后的糖型(top)

五个含量最高糖型与理论分子量的对比(table)

单抗经过DTT还原可将链间二硫键打开，得到独立的轻链（LC）和重链（HC）。LC和HC经RP-LC分离后，依次进入质谱中检测。结果如下图所示，图A为LC和HC的色谱峰，图B为LC对应的质谱图，图C为HC对应的质谱图。

▲（A）Rituximab还原后LC和HC的色谱峰；(B) LC的质谱图；(C)HC的质谱图。图 C中插入的图谱为 z=+25部分的放大, 显示了代表3个不同糖型的峰图

将HC用软件去卷积化处理后，结果在下图中。单抗的主要糖型G0F、G1F和G2F清楚的显示在谱图中。在下图的表格中，G0F(50514.055)、G1F(50676.484)和G2F(50838.453)各糖型修饰的HC的分子量都有对应的强度（sumintensity）信息，根据此强度信息可以粗略估算G0F、G1F、G2F的相对比列。

从以上IgG1单克隆抗体例子可以看出：与完整蛋白相比，质谱检测还原得到LC和HC会落在更低的m/z范围和得到更高的分辨率，从而提高了检测的精确度。并且，完整分子量两条HC各有一个糖基化位点，检测到分子量差异为两个糖基化位点的糖型组合，还原分子量中HC的糖型会更简单明确。如果抗体上有两个N糖基化位点，如西妥昔单抗，除了Fc区的N糖基化位点外在Fab区的重链还有一个N糖基化位点。在这种情况下，可利用Papain酶在铰链区将单克隆抗体切断，后经DTT还原得到LC(light chain)、Fab heavy chain和Fc/2片段，分别检测Fab heavy chain和Fc/2的分子量，以分别对Fab区的N糖基化和Fc去的N糖基化进行分析。具体数据在本文中，不再赘述。

糖型数据库：基于质谱的检测数据，可以利用一些数据库搜索工具来分析糖基化Profile。下表列举了常用的基于库匹配（library match）的搜索引擎，如GlycoMed是一种网络搜索工具，其数据库源自预生成的silico library of glycan mass。

其他糖肽分析：除单克隆抗体外，融合蛋白、酶、凝血因子等药用蛋白都多个糖基化位点。对于多个糖基化位点的样品，N-Glycan released 分析方法不能特异性的解析出各位点的糖基化修饰的情况。而糖肽分析可以鉴定糖基化位点、解析寡糖结构和得到位点特异性的糖型修饰信息。糖肽的样品处理流程并不复杂，在糖蛋白经变性还原处理后，用蛋白水解酶（如trypsin）将蛋白水解成特定的肽段后进入LC-MS中分析。糖肽分析有很多优点并有重要意义，但同时糖肽也具有很多挑战性。糖肽的分析方法比N-Glycan released方法更加复杂：糖基化肽段的离子化效率较低，且寡糖糖链比肽段骨架更容易碎裂，糖肽的MS/MS谱图非常复杂给数据分析带来很多的困难。

以Charles C等人的糖肽分析方法为例对糖肽分析做简单的介绍。该方法将bovine lactoferrin（包含N糖）、kappa casein（包含O糖）和bovine fetuin（包含N糖和O糖）混合制成糖蛋白混合物，这些糖蛋白含有丰富的糖基化位点。该糖蛋白混合物的糖肽分析流程如下图所示。糖蛋白混合物经PronaseE水解肽段，在SPE柱脱盐和富集之后，由Nano-LC/Q-TOFMS检测并采集数据。数据由in-house软件Glycopeptidefinder分析。

▲N-糖肽和O-糖肽复杂混合物的处理流程

在此方法中使用非特异性的蛋白水解酶PronaseE可以在同一个糖基化位点上得到不同大小的肽段，特异性蛋白水解酶（trypsin）得到肽段单一可能会因肽段过大等原因不容易被质谱检测到，PronaseE的非特异性酶切在一定程度上避免了这个问题。

糖肽的匹配是基于一级精确分子量(MS)和二级碎片离子信息（MS/MS）。当实测的质量与糖肽的理论质量在20ppm内，MS/MS的信息可以进一步提供可靠和清晰的确认。在CID碎裂模式下，糖肽会产生一些糖碎片特征峰（见下表），这些碎片可以作为糖肽的标志。

下图为三个糖肽MS/MS谱图的去卷积化之后的信息，图中清晰的展示了CID模式下糖肽的MS/MS谱图由糖的碎片和肽段上连接不完整寡糖碎片组成。

 ▲(A-C)Bovine lactoferrin处理后三个糖肽MS/MS谱图的去卷积化信息. 绿圈为甘露糖，黄圈为半乳糖，蓝方块为GlcNAc.

在对糖肽进行匹配之后，可以在TIC图提取各个糖肽的EIC图。下图是一张有代表性的糖肽的EIC谱图。下表中罗列出糖蛋白混合物中一部分糖肽的信息。

▲（A）20% ACN固相萃取糖肽的ECC信息；（B）40% ACN固相萃取糖肽的ECC信息。ECC: Extracted compound chromatogram.

对bovine lactoferrin（包含N糖）、kappa casein（包含O糖）和bovine fetuin（包含N糖和O糖）糖蛋白混合物的糖肽LC-MS数据分析，共检测到233条糖肽信息，此三个蛋白一个包含18个糖基化位点。糖基化位点和各位点上糖型见上图。

N-glycan自身的合成

首先是N-Glycan自身的合成。N-glycan的合成从内质网膜开始，核糖UDP-GlcNAc上的phospho-GlcNAc转移到Dolichol-phosphate（多萜醇磷酸），形成Dol-P-P-GlcNAc。随后一次加上1个GlcNAc、5个Mannose（甘露糖），每一步反应都由特定的酶催化，修饰的位置也是严格固定的。这些酶以ALG（Asparagine-Linked Glycosylation）命名，每个酶由独立基因编码。

形成的Dol-P-P-GlcNAc2Man5是一个节点，该中间体将有膜表面进入到内质网腔内，继续后续的糖基化修饰。

N-glycan连接到蛋白质上

在内质网腔中，Dol-P-P-GlcNAc2Man5会继续加上4个Mannose、3个Glc（葡萄糖），形成14个单糖组成的N-Glyan：Dol-P-P-GlcNAc2Man9Glc3，成熟的N-Glycan被连接到刚刚进入内质网的蛋白质N-糖基化位点上Asn-X-Ser/Thr上。

N-glycan在内质网中的加工

蛋白质加上Dol-P-P-GlcNAc2Man9Glc3以后，会继续进行糖基化的加工，同时完成蛋白折叠。N-glycan和N-glycan结合的分子伴侣在蛋白质折叠过程中起到关键作用。首先是膜上的糖苷酶MOGS水解掉一个Glc，然后游离可溶的糖苷酶GANAB水解掉第二个Glc，产生的Glc1Man9GlcNAc2在分子伴侣calnexin（钙连接蛋白）或者calreticulin（钙网织蛋白）的作用下进行折叠。折叠的同事，最后一个Glc被GANAB水解掉，如果此时折叠仍未完全，一种糖苷转移酶UGGT会结合到疏水口袋，并加上一个Glc，然后在分子伴侣帮助下继续折叠，这个循环进行直到折叠完全。正确折叠的Man9GlcNAc2修饰蛋白被XTP3-B识别并保护，然后中央的一个Mannose被内质网内甘露糖苷酶ERMAN1水解掉,形成Man8GlcNAc2，后者被LMAN1/MCFD2复合物中的ERGIC-53识别，转运到ER-Golgi intermediate compartment（ERGIC）中。对于没有正确折叠的糖蛋白，在不同阶段会在蛋白酶体或者ERAD途径被降解。

N-glycan在高尔基体中的加工

N-glycan在高尔基体中将进一步加工成熟。如果在内质网中，N-glycan的葡萄糖没有完全切掉，高尔基体endo-甘露糖苷酶将从Mannose处切断，释放Glc_1-3Man。末端的Mannose被高尔基体I型甘露糖苷酶MAN1A2依次切掉，形成Man5GlcNAc2。MGAT1识别该底物，加上一个GlcNAc，如果不继续加工，会在中间高尔基体加上一个Gal和唾液酸，形成一个Hybrid的糖型。但一般情况下，Man5GlcNAc会被高尔基体II型甘露糖苷酶MAN2A1切掉两个Mannose，并在MGAT2的作用下加上第2个GlcNAc形成GlcNAc2Man5GlcNAc2。该糖型可作为多种糖苷转移酶的底物，如MGAT4、MGAT5、MGAT6等，所以会形成分支型的复杂N-glycan。

在更多情况下，进入反式高尔基体后，通过FUT8的催化，会在Asn连接的GlcNAc上加上一个岩藻糖。随后在一种半乳糖苷转移酶B4GALT1的作用下，在2个末端的GlcNAc上各加上一个Gal（半乳糖）。然后在一种唾液酸转移酶ST3GAL1的作用下，在2个末端的Gal上各加上一个唾液酸（至少存在5种以上的唾液酸转移酶）。最终成熟的N-glycan修饰蛋白从高尔基体分泌出来。

上市的抗体药物基本限于Fc的单一N-糖基化修饰，但因其糖型组分和含量不一致，仍有一定复杂性，尤其给生产稳定性和类似药开发带来了挑战。

不同物种的糖基化是不同的。

细胞系的影响：工业上常用的CHO、NS0细胞系，其糖谱和人源的并不完全一致。

如前文所述，抗体药物的糖基化修饰过程极为复杂，而且与纯化工艺也有关系，因而糖基化修饰的过程必定受到多种因素的协同影响。

随着抗体药物的快速发展，业界已经积累了关于糖基化修饰影响因素和机制的有限了解，这些案例的积累进一步促进糖型和控制，并进一步助推其机制的深入研究。

表二细胞培养过程影响糖基化修饰的因素

注：相互关系引自文献案例。

抗体药物的快速发展，促进工业界越来越重视糖基化的修饰过程、分析、控制、SAR关系，其复杂程度要求从更宏观和整体的角度来审视。工业界的努力也带来了许多变化，从重点关注分析到控制，从优化稳定细胞培养工艺到糖基化改造，从形式分析到SAR分析，如类似药糖基化可比性研究、糖基化改造在迭代抗体药物、PD-1/PD-L1抗体药物中的抗体亚型/糖基化改造差异性选择策略，都将积累更多的数据和经验，推动对糖基化更深入的理解。

感谢某匿名朋友帮助撰写了糖基化分析部分的内容。

参考资料：

• Challenges of glycosylation analysis and control=an integrated approach to producing optimal and consistent therapeutic drugs(2016)；

• N-linked glycans(2016)；

• N-glycosylation heterogeneity and the influence on structure, function and pharmacokinetics of monoclonal antibodies and Fc fusion proteins(2016)；

• GlycoFi s technology to control the glycosylation of recombinant therapeutic proteins(2009);

• Glycosylation of Therapeutic Proteins(2010);

• The Emerging Importance of IgG Fab Glycosylation in Immunity(2016)

• Glycosylation of Monoclonal Antibody Products =Current Status and Future Prospects(2016)

• LC/MS Analysis of the Monoclonal Antibody Rituximab Using the Q Exactive Benchtop Orbitrap Mass Spectrometer；

• A Complete Workflow Solution for Intact Monoclonal AntibodyCharacterization Using a New High-Performance Benchtop Quadrupole-OrbitrapLC-MS/MS；

• Charles C. Nwosu,Richard R. Seipert, John S. Strum, Serenus S. Hua, Hyun Joo An, AngelaM. Zivkovic, Bruce J. German, and Carlito B. LebrillaSimultaneous and ExtensiveSite-specific N- and O-Glycosylation Analysis inProtein Mixtures

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