通过一周的文字整理与视频编辑，终于把国庆前孙乐博士的在线交流（2016版FDA有关蛋白药免疫原性方法学建设和验证指南）整理出来啦，让大家久等了，表示抱歉。在这里感谢孙乐博士的辛勤付出，还有视频制作的人语喧同学，还有问答整理的Tolerant老师。在此一并感谢各位一直支持生物制品圈的同仁！
1、蛋白药的抗药性怎么理解？它是怎么产生的？
A. 蛋白药的抗药性至少一部分是因为一些病人多次使用该药以后产生了识别该蛋白药的抗体（抗药抗体，anti-drug antibody ADA），其中一些ADA具有中和活性，直接抑制了药效，还有一部分ADA结合药物后或启动免疫系统的CDC和/或ADCC功能把药物给降解了，或形成复合物沉积到肾脏，把血药浓度降低了。
2、为什么会延缓药物的清除呢？
A． 如果ADA结合的是蛋白药的非功能区，形成的药物-ADA复合物分子量显著变大，反而不容易通过肾小管被从血液里过滤掉，延缓了清除。另外，蛋白药或多肽药被ADA结合后，也可能反而不容易被血液里的蛋白酶降解掉。
3、 ADA产生的周期大约是多少？
A．IgM亚型的ADA会马上产生，但是IgG亚型ADA在2周后就能够检测到。
4、B细胞位点指什么？
A. B细胞位点（B cell epitope）指的是蛋白上能够诱导抗体产生的位点，可以是线性的氨基酸序列，也可以是蛋白上修饰的糖基，还可以是三维空间构想。形象地比喻就像一个人能够让你印象深刻并且下次再见到他马上能够认出的一些特征。抗体的已知抗原位点是B细胞位点的一部分。
5、 如何检测二聚体，三聚体？
A. 10～20um的颗粒一般采用光阻法。安进同时还用光阻法和微流成像法分析2～10um的颗粒。另外，还提到SEC-HPLC-UV、DSC等方法分析四维结构。
6、罗氏PD1没有糖基化，其稳定性受影响吗？
A． 泛泛而谈，没有糖基化肯定影响抗体的稳定性。但是罗氏PD1抗体是否遇到稳定性问题，我不清楚。
7、ADA和Nab检测方法的区别？
A. Nab(Neutralizing antibody)是ADA的一种。可能听众想问的是Nab和Bab（Binding antibody）检测的方法区别。常见的Nab检测方法有两种：一种是ELISA方法，比如用抗原包板，然后用受试者血清样本里的ADA去阻挡抗体药去和板上的抗原结合。这个办法因为包板抗原量比较高，检测灵敏度比较差，目前用于临床前分析比较多。另外一种是用生物活性方法，用受试者血清样本里的ADA去阻挡抗体药和培养基里或细胞表面的抗原结合来抑制抗体药的活性。这个办法更接近临床实际情况，检测灵敏度也更高，新版FDA要求临床样本分析必须用这个方法。但是生物活性方法，实际做起来，非常有挑战性，包括重复性、工作量等。
8、 抗癌药物是否无需人源化处理？
A. 虽然我前面说到一方面，部分癌症病人就是因为免疫功能不行才得癌症，另一方面抗体药很贵，绝大部分病人是化疗放疗都无效了才用抗体药。对于这些病人，即便给的抗体药免疫原性很强，病人也不会产生很多的ADA。但是，像抗PD1这类免疫调控抗体药，它们将提升病人的免疫功能，罗氏的PD-L1抗体药的ADA发生率高达41.5%。
9、ADA阳性抗体滴度大约多少能满足实验要求？
A．如果指的是用佐剂帮助下免疫产生的阳性对照猴血清，我们通常要求滴度至少达到1：1万以上。
10、提高drug tolerance 的方法有哪些？
A. 对于蛋白药或多肽药，可以通过酸处理来改进。但是因为大部分蛋白药或多肽药半衰期远远短于ADA的半衰期，可以在最后一次给药后1周后测。但是对于抗体药，没有什么特别好的办法。酸处理加沉淀法是无法把抗体药和ADA分开的。酸处理加和抗原结合把ADA从抗体药上面洗下来，反应条件是用某一个固定亲和力的鼠ADA单抗探索出来的，并不表示这个条件适合猴或人ADA多抗（不同时间猴ADA的亚型、亲和力混合都不一样）。我们现在1办法只能检测自由的ADA。个人觉得把方法学灵敏度做的尽可能高，这样检测的时候把血清稀释100倍，争取把稀释后的血液浓度降低到0.2ug/ml以下，减少它们与包板抗体药之间的竞争。
11、用spr可以检测ADA吗？
A．SPR是检测ADA的方法之一，尤其是在不能用二抗的情况下。但是，它的通量和成本都是问题。
12、有没有针对人源化抗体受体融合蛋白药物得到ADA检测试剂盒？
A. 如果指的是人Fc和GF Receptor胞外区的融合蛋白，我们没有现成的ADA试剂盒，但是可以定制。
13、有特异抗体检测Pegylation protein 中接头及PEG部分吗？
A．FDA提出临床样品分析要做这些部分的ADA检测，但是它没有给出任何参考文献。我们还没有做过，只是有点思路。
14、PEG在体内产生抗体吗？
A. 因为直链PEG本身免疫原性差，故之前药企用它修饰蛋白来增大蛋白药分子量延长半衰期，同时还能够降低蛋白药的免疫原性。但是，现在的PEG分子量大小各异而且还分叉的，另外用的Linkers也越来越多。这些改动都会增加PEG修饰带来的新免疫原性。我想肯定是有PEG化修饰的蛋白药在病人体内产生了严重的ADA，否则FDA不会特别把它挑出来。
15、有没有方法可以鉴别ADA是针对Fab的还是Fc的？
A．目前我们的方法中在反应体系中有1%或更多的人血清，人血清里有50mg/ml的各种亚型的人IgG，如果有针对Fc部分的ADA，应该也被封闭掉了，故能够检测出来的都是识别抗体药可变区的。
16、贵公司制备的抗阿达木抗体是用的商品化的阿达木还是自己表达的阿达木免疫的呢？
A. 我们的抗阿达木ADA鼠单抗和猴多抗都是用原研药制备出来的。
17、lucentis局部用药也会有这么强的免疫阳性？
A．是的，有1-5%的病人产生ADA。可能和它直接注射到眼球里面有关系，我们的眼睛是做容易发炎的。
18. MSD方法属于ELISA吗？
A. MSD方法是指的用电化学发光法，其中的抗原-抗体结合反应和ELISA相同，只是加上电化学和发光，灵敏度比颜色反应的ELISA更好，当然价格也更贵。
19. 蛋白药在体内可存在多久？
A．每个蛋白药的半衰期都不同，取决于分子量大小、对酶和酸的敏感度等等。
20、抗体药多聚体有没有好的办法去除以及检测？
A．没有什么简易可行的办法把抗体药多聚体去除掉，最好的办法是不要让它产生。检测方法前面已经介绍。
21、Humira的ADA高原因是什么？它和别的全人源抗体差异只在CDR，其余的是公用的吧。
A. 我们的软件分析和后来的动物实验结果证明阿达木的ADA高首先是它的可变区中的氨基酸序列B细胞位点太强。它的框架区和别的抗体药也不一样。另外，也和它的给药途经有关。
22、 您刚才讲的动物试验ADA结果可以预测人体，如果人体较低发生率可以解释，如果在人体ADA高于动物试验，怎么解释？
A． 像类风湿这样的病人，他们的免疫功能是远远超过正常人，故他们产生的ADA就会比正常动物实验中观察到的ADA要高。
23、怎么提高ADA检测的耐药性？特别是cell based
A. 我们马上做过cell based的工作，所以我们也不知道如何改善。
24、阳性血清大概需要多少才能完成临床前研究？
A．临床前研究分析样本少且周期短，有0.1ml猴阳性血清就够了。大部分抗体生物类似药，我们有阳性猴血清卖。
25、这种中和性抗体和抗独特型抗体是否相同？
A． 抗体药Nab只是Anti-Id的一部分。就像认在手指头背面的抗体是手指头特异的，但是并不影响你抓东西。
26、 阳性质控样品必须经抗原亲和纯化吗？经ProteinA亲和是否可行？
A．阳性质控品是用阳性血清直接稀释而成。用来确定检测灵敏度的阳性标准品是纯化的鼠单抗或抗原免疫亲和纯化的猴或者兔多抗，因为在阳性血清里面只有很少一部分是针对蛋白药的。报告中我特别指出，如果是做抗体药的阳性质控品，抗体药免疫亲和纯化的兔多抗也是不合格的。
27、蛋白药物室温无菌保存可存多长时间后仍然有效？
A. 不同蛋白各不相同。
28、 Humira是FDA批准的第一个全人抗体，全人抗体相对于嵌合抗体和人源化抗体在免疫原性问题上有改善吗？
A． 在今天介绍的这个2016版FDA指南里面，FDA特别指出全人源对免疫原性提高没有显著效果。
29、Detergents如何引起免疫原性的？在制剂中很常用的吐温-80、吐温-20
A．Detergents都是有一个疏水基团和一个亲水基团组成的，而这个亲水基团往往是比较复杂甚至多个羧基，它们的免疫原性大大超过了我们平时作为免疫佐剂的石蜡油。不小心把肥皂水闹到眼睛里是不是很难受，甚至眼睛都会红？那就是免疫反应。
30、重组人胰岛素是不是可以不用做免疫原性实验？而胰岛素类似物如甘精胰岛素之类的，因涉及基因改造，是不是就得做免疫原性实验？
A．高质量的重组胰岛素是不会诱导ADA的，否则病人们早就对胰岛素失效了，因为它们都是皮下注射。我们曾经用胰岛素在佐剂的帮助下去免疫动物，一点反应都没有。后来我们只能把它拆开才获得抗体。而现在上市的这些突变或修饰的胰岛素，至少我们接触过的几种，做抗体容易多了。据我所知，它们是需要做免疫原性评价的，至少有好多家国内企业委托我们做它们的ADA阳性猴血清。 我担心这些改进型胰岛素半衰期是变长了，但是B细胞表位漂移有可能导致病人产生抗胰岛素本身的ADA，那就麻烦大了。
31、你们的proteinA残留试剂盒具有针对不同厂家的专属性吗？
A．我们的Protein A残留试剂盒用的一对单抗识别的是Protein A上非抗体结合区，而不同厂家的Protein A改动的部分主要是在抗体结合区，理论上来说我们的试剂盒应该是可以测不同厂家的Protein A. 目前我只知道我们的盒子可以测到国内很多家抗体药里面的Protein A残留，但是我们不知道它们用的是谁家的Protein A. 如果您需要，可以给我们寄一点抗体药来我们测一下，或我们给您提供一个盒子免费试一试。
32、阳性质控品和标准品不一样吗？不都是用来进行做阳性对照吗？在ADA验证试验中，这两个如何区分呢？
A. 阳性标准品是鼠ADA单抗或者是免疫亲和纯化的多抗，是用来判断方法学的灵敏度用的，必须是ng/ml来表述。标准曲线不是每次实验都要做的，往往是在建方法学和验证方法学的时候做一下。而强、中、弱、微弱阳性质控品是用正常人血清作为介质不同稀释度的猴阳性血清，它们是在每块板上或每组实验中都必须加上的，是用来判断该块板上的数据是否可以用，是内控。
33、用全人源化抗体去免疫食蟹猴只会产生抗Fab抗体而不产生抗Fc抗体，因为人源抗体Fc不能被识别为异源，是这样？
A． 因为人的Fc和猴的Fc非常相似，故用人抗体药去免疫猴子虽然也会产生一些抗人Fc的猴抗体，但是比例不会超过50%。而且当我们用抗体药去免疫亲和纯化猴血清中的ADA，获得的应该都是认可变区的。顺便提醒大家，Fab和可变区不是一回事。Fab是酶切位点决定的，里面含有一部分Fc。
34、老师，标准品可以是鼠抗，阳性对照必须是猴多抗，这样理解吗？
A. 是，标准品可以是鼠单抗，阳性对照最好是猴多抗，因为它最接近病人的血清。
35、所用标准品中的单抗，都是指中和抗体吗？
A. 作为Bab筛查标准品，不一定是中和抗体。但是在Nab分析时，则需要有中和活性的ADA鼠单抗做标准品。
36、做标准曲线的稀释液一定是纯血清吗？还是可以把纯血清稀释?
A. 标准曲线中必须含有阴性猴或者人血清，它们的含量则取决于待检血清的稀释倍数，二者应该一致。在此提醒大家，用不含血清的稀释液做标准曲线绝对是不对的，请关注。
37、null CHO 用细胞裂解液还是上清？
A．制备全细胞CHO宿主HCP的抗体，我们用的是深过滤后的裂解液。
38、 你们可以制研发工艺过程特异性HCP试剂盒，外包费用大概多少？刚才提到FDA对抗体药有要求做工艺特异性HCP试剂盒检测？ HCP试剂盒：null CHO cell走完纯化工艺再收集杂蛋白，那需要很大规模的培养？杂蛋白的量要求多少？
A. 工艺特异性HCP试剂盒研发的费用应该在20万左右。但是客户的投入是非常大的。药典规定抗体药中的HCP不能超过50-100PPM（mg/kg），而研发这个试剂盒我们需要免疫10只兔子至少100mgHCP，这意味着你们需要做相当于1公斤的抗体药生产或者2000升的发酵，并且所有的发酵罐、管路、柱料都必须是新的。得花多少钱？我们现在是反过来做，根据文献和中检院检测分析的结果，把20余种在国产抗体药中常见的CHO蛋白重组表达出来制备单抗，配对。将来，只需要把您的抗体药拿来用我们的CHO-HCP抗体库一筛，有什么，我们给您配什么。这就不仅是工艺特异的，而是产品特异的HCP检测试剂盒。
39、 对于甘精胰岛素、门冬胰岛素和人胰岛素差别很小，只是个别氨基酸差异，你们能制备出特异针对甘精胰岛素的抗体吗？
A. 是的，我们有成功的经验。
40、临床使用猴多抗建立的间接ELISA方法是否认可？
A. 针对蛋白药，间接ELISA方法是认可的。
41、如果是使用空白细胞发酵上清走一遍纯化步骤来制备HCP的话，那些通过与单抗药物结合而残留的HCP将会丢失？
A．是会丢失的，故前面我提到我们在反向做。
42、孙老师，请问您28天制备单抗是怎么做到的，全世界就您一人吗？
A. 当时MedImmune（现在是阿斯利康的下属）在开发一个非同源2聚体疫苗，需要有一个单抗只识别完整的二聚体疫苗。他们做了2年拿到的都是识别其中一个单体的单抗，后来让我们帮助他们做，我们只用了28天就拿到了。因为抗原是疫苗，免疫原性很强，所以只免疫了10天。回国后在2008年手足口EV71爆发时，我们和中国CDC合作，用多肽作为免疫原，花了35天拿到了中和活性单抗。
